细胞凋亡实验步骤及简介

一、试验最终目标

1、掌屋衰老蛋白质的型态型态 2、学会用红部份探针对蛋白质透过双标明来检测较长时间能活蛋白质、衰老蛋白质和肿胀蛋白质的工具

二、试验原理

蛋白质死亡根据其性质、是从及脊椎动物学意味辨别为衰老和肿胀两种不同一般来说。衰老普遍发挥作用于永生界，在脊椎动物个锥体和适应环境中所起着非常关键性的不作用。它是蛋白质在一定生理前提下一系列顺序排列牵涉到事件的组合，是蛋白质遵循一定表征自己结束永生的独立自主控制反复。蛋白质衰老具有可辨认的灵长类和脊椎动物化学型态。

在型态上可见衰老蛋白质与周围蛋白质脱离碰触，蛋白质变园，蛋白质膜向内皱缩、胞浆浓缩、细胞质蚕食、蛋白质加成器固缩过热呈圆形团块形如或新月形如分布区、细胞质和蛋白质膜进一步融为一体将蛋白质分为多个完拆成中空的衰老小锥体，衰老小锥体最后被吞噬蛋白质吞噬新陈代谢。在衰老反复中所蛋白质以下内容物非常释放到蛋白质部份，可能会影响其它蛋白质，因而不激起炎症加成。

在脊椎动物化学上，多数蛋白质衰老的反复中所，诱导加成器酸内切蛋白质能激活，能活性增加。加成器DNA随机地在加成器小锥体的连接部位被蛋白质切断，水解为180-200bp或它的拆成倍数的各种片断。如果对加成器DNA透过琼脂糖PET，可辨识以180-200bp为基数的DNA ladder（梯形如带纹）的型态。

相比之下，肿胀是蛋白质正处于无可避免细菌感染前提下牵涉到的蛋白质死亡。蛋白质在肿胀现代即归因于质膜相容性，各种蛋白质器增大，进而质膜崩解释放出其中所的以下内容物，激起炎症加成，肿胀反复中所蛋白质加成器DNA虽也水解，但由于发挥作用各种长度不等的DNA片断，只能形成梯形如带纹，而呈圆形弥散形如。

一些平易近人的细菌感染刺激及一些抗药剂可抑止蛋白质衰老，并不一定这些因素在抑止衰老的同时，也可抑止蛋白质肿胀，这取决于细菌感染的无可避免程度和蛋白质本身对刺激的脆弱程度。

冬青酰酰（HT）是我国而无须研制的一种对急性粒蛋白质肺炎，急性单加成器肺炎等有良好的抗药剂。深入研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内不作用2小时，即可抑止HL-60蛋白质衰老，并表现出迥然不同的衰老型态。本试验用1μg/ml HT在锥体部份抑止培植的HL-60蛋白质牵涉到衰老，同时也有少数蛋白质牵涉到肿胀。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对蛋白质透过双重皮肤上，可以不同之处衰老、肿胀及较长时间蛋白质。

蛋白质膜是一选择性的蛋白质培植，一般的脊椎动物染色剂如PI等只能越过质膜。当蛋白质肿胀时，质膜不完拆成，PI就转入蛋白质部份部，它可缓冲到DNA或RNA中所，使肿胀蛋白质制做，衰老蛋白质和能活蛋白质不制做。而一些能活蛋白质染色剂由于为亲脂性水银体，可跨膜转入能活蛋白质，因而可透过能活蛋白质皮肤上。Hoechst33342是一种能活性红部份染色剂且口服较弱，它是双苯并咪唑的一种衍脊椎动物。与DNA特异结合（主要结合于A-T）酰基区），辨识衰老蛋白质和能活蛋白质。凡是看到有衰老小锥体的蛋白质都是衰老蛋白质。

三、试验用品

1、醛：冬青酰酰（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTA蛋白蛋白质、酰性裂解水银：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠：3mol/L KAc（pH4.8）；异丙醇；70%混合物；溴酚蓝，蔗糖指示剂。TBEPET蛋白蛋白质，1%琼脂糖，溴乙锭。PI母水银：500μg/ml；Ho33342母水银：2mmol/L。 2、仪器设备：红部份孔径，PET仪，PET槽，微量加样器（1ml，100μl）0.5、1.5ml离心管，载玻片，盖玻片。

四、试验金属材料

人早幼粒肺炎HL-60蛋白质，用包涵10%公牛队血清的RPMI1640菌种在37℃，5%CO2前提下培植。

五、工具步骤

1、冬青酰酰抑止HL-60蛋白质衰老 （1）试验前约24小时，传染两玻璃瓶HL-60蛋白质，标明①、②，每玻璃瓶包涵约6ml培植水银，置37℃，5%CO2培植箱培植。 （2）试验前约2.5小时，当蛋白质通量达到70%，①号玻璃瓶重新加入冬青酰酰200μl，使终浓度为1μg/ml，②号玻璃瓶中所重新加入同等量PBS（pH7.4）不作比对。共同放入培植箱中所继续培植2.5小时。

2、Ho33342和PI双重皮肤上辨认三种蛋白质 （1）皮肤上：将玻璃瓶中所的蛋白质摇匀取200μl于1.5ml的离心管中所，重新加入Ho33342母水银2μl，PI 20μl，皮肤上15分钟。 （2）滴片：取一载玻片用双面胶围成一小室，从离心管中所各取以上皮肤上后的蛋白质悬水银10μl，重新加入小露天盖上盖玻片，红部份镜下用紫部份展示出亮，高倍镜下通过观察，不同之处三种蛋白质，并注意三者%。

六、要点

1、抑止培植HL-60蛋白质时间要直观； 2、红部份孔径下通过观察蛋白质时，由于红部份易碎叛，通过观察时要尽量快。