A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro
Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*
▋摘要
氛围：现前期正肆虐全球的新型病原受到感染病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国内和北部大流行，截至 2021 年 4 年末已造成最少 1.28 亿人受到感染，最少 280 万人受害。当前，已为可理论上减缓 COVID-19 受害率的病患方式。我们研究成果了一种现代的籽制剂制剂——欲求肺毒制剂液 (RDS) 的潜在效病原受到感染能活性，该制剂液主要糖类为东方针灸现代之前可用病患肺部癌症的之前药用植物。
结果：RDS 诱导 SARS-CoV 太快受到感染者、SARS-CoV-2 太快受到感染者、混合SARS病毒受到感染者-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 假型受到感染者以及传染性 SARS-CoV-2 和独有的 Ha-CoV-2 兰花受到感染者 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对靶肝细胞的受到感染。我们更进一步断言了 RDS 可以实际上灭能活 SARS-CoV-2 受到感染者粒状的传染性。此外，我们注意到 RDS 还可切断SARS病毒SARS受到感染者对靶肝细胞的受到感染。
论断：RDS 可广为诱导颤动道受到感染者受到感染。关键词：SARS-CoV-2，COVID-19，病原受到感染，效受到感染者病患，欲求肺毒制剂液，现代籽，SARS-CoV，SARS病毒SARS，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 假型受到感染者
▋氛围
现前期正肆虐全球的新型病原受到感染病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国内和北部大流行，截至 2021 年 4 年末已造成最少 1.28 亿人受到感染，最少 280 万人受害。当前，已为可理论上减缓 COVID-19 受害率的病患方式。新不止现的 COVID-19 受到感染者病菌为病原受到感染 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在致使急性颤动病症系统性病原受到感染各种类型之前的姊妹受到感染者[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 原先都是在之前国注意到的；SARS-CoV 受到感染者于 2002 年 11 年末在珠海市首次被注意到[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 年末在武汉首次被注意到[1,7,8]。在之前国，这两次由病原受到感染引来的疫情之前，籽仅被广为用到，需用紧急应付病原受到感染引来的癌症。对于当前的 COVID-19 大流行，之前国有最少 85% 的 SARS-CoV-2 受到感染患者接受了现代之前医药麻醉药（9，10）。许多用到的籽到底有着理论上的效病原受到感染特点并在临床上到底理论上，这个不可忽视问题已为给予充分答复。
籽作为病患病原受到感染所引发癌症的理论上麻醉药，但由于依赖于人体内或灌注的系统会研究成果，其其发展与合理用到仅受到了阻碍。为了确切籽的潜在效 SARS-CoV-2 能活性，我们从常用籽之前检查了多种药用植物催化物，并从籽制剂液 RDS(旧金山一种商业性性食品处方药) 之前注意到了效 SARS-CoV 和效 SARS-CoV-2 受到感染者的能活性，一种在旧金山的商业性食品处方药。RDS 可用增强消化道颤动系统会的总体健康，其包则有多种药用植物糖类，如籽和铁线莲，它们是现代上可用压制发炎和肺部癌症的之前药用植物 (11-13)。在此，我们美联社 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 假受到感染者以及有着受到泌尿道的野生型 SARS-CoV-2 受到感染者对靶肝细胞的受到感染有着诱导抑制作用。我们更进一步断言 RDS 可通过实际上灭能活受到感染者粒状或解救受到感染者渗透而诱导受到感染者的晚期受到感染延迟。此外，我们注意到 RDS 还可以解救甲流受到感染者对靶肝细胞的受到感染。这些结果表明，RDS 对颤动道受到感染者的受到感染或许有着广为的诱导抑制作用。
▋结果
为了从现代之前药用植物之前找到潜在的效 SARS-CoV-2 能活性，我们从达四十种现代药用植物之前检查催化不止 SARS-CoV-2S 细胞内假型太快受到感染者[14,15] 和消化道肺部 A549(ACE2) 靶肝细胞，此人类文明 ACE2 基因但会通过太快受到感染者转导作为媒介介导，从而稳定转导来实现极限强调。太快假型受到感染者用到深蓝色白光细胞内 (GFP) 或白光素酶 (Luc) 作为美联社基因，并通过了有着广谱效受到感染者进入诱导剂，以及纳西阿克 (Arbidol)[16]，和人类文明效毒血清对效 SARS-CoV-2(三幅 1a、C) 的正确性。我们只能尝试监测到纳西阿克 (Arbidol) 和效毒血清对于 SARS-CoV-2 假型受到感染者的诱导抑制作用，这是我们在其他四十余种现代药用植物催化物测试者之前没有注意到的，之外其之前一些长期存在很高毒素的药用植物 (三幅 1a-C)。然而，鉴于太快性假型受到感染者至少能监测 SARS-CoV-2 受到感染者的渗透行为，我们不可排除这些药用植物催化物或许有在进入后前期只能诱导 SARS-CoV-2 的或许性。我们更进一步从现代制剂欲求肺毒制剂液 (RDS) 之前检查不止了或许的效 SARS-CoV-2 能活性，该新产品则有有大类药用植物糖类——、莴苣、籽、铁线莲、紫菀、苦杏仁、蜂房、皂角、绿叶，在之前国现代上可用病患肺部癌症 (11-13)。
则有有烷基咖啡碱、3，4-二邻咖啡羟基理论上成分碱、烷基 3，4-二邻咖啡羟基理论上成分碱、原儿茶碱、烷基绿原碱和荨麻草素；花蕾之前还则有有苯甲碱 A、B 和 10 种可知环烯醚糖类苯甲碱[17]；该动植物还则有有皂茴香茴香 A 和 B，以及效发炎抑制作用的苯甲碱 C[18,19]。莴苣酰胺苯甲碱之前则有有木脂素、松脂醚和莴苣苯甲碱[20]。籽之前则有有被专指籽皂苯甲碱的甾体皂苯甲碱，是籽同属动植物十分相似的动植物糖类[21,22]。细叶铁线莲之前主要能活性糖类为四种单糖类，(−)-香草酮、(+)-普博梅斯酮、(−)-柠檬烯和 (+)-香草苯酚；这种动植物还则有有其他锂，如 1-辛烯-3-醚、3-辛酮、β-年末桂烯和β-石竹烯[23]。紫菀则有有最少 162 种锂，之外环烯醚糖类和环烯醚糖类苯甲碱、苯丙苯甲碱、有机碱、内生、糖类、黄酮类、和皂苯甲碱[24]。苦杏仁之前则有有酚类、丙酮锂和果胶多糖[25]。皂角刺之前则有有皂苯甲碱和羽扇豆碱[26,27]，而绿叶之前则有有主要能活性糖类绿叶碱[28]。为了更进一步测试者 RDS 的效 SARS-CoV-2 能活性，用不同一系统性碱度的 RDS 模板 A549(ACE2) 肝细胞，然后让这些肝细胞在长期存在 RDS 的情况接受 4-6 星期的受到感染。受到感染后，在不长期存在 RDS 的情况培植肝细胞，然后在 48 和 72 星期的时候，通过流式肝细胞拳法对受到感染者受到感染的诱导抑制作用展开系统性。为了压制肝细胞毒素，用到氯化丙啶 (PI) 对再一受害和已受害的肝细胞展开切片，至少在能活肝细胞群之前数据资料分析 GFP+肝细胞。如三幅 2 下图，我们检视到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 假受到感染者有着副作用反之亦然诱导抑制作用。为了声称这些结果，我们用到不可逆强调 ACE2 的 VeroE6 肝细胞单调了该受到感染实验室。
(闻下页三幅)
ACE2 内部强调，生产性 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 受到感染者可对其展开受到感染，ACE2 通常可用病原受到感染的研究成果 (7)。考虑在依赖于 ACE2 极限强调 [15，29，30] 的情况，假型受到感染者对 VeroE6 的受到泌尿道更高，我们还用到了白光素酶美联社基因假型受到感染者，该受到感染者的美联社基因强调由 HIV-1LTR 和 Tat 驱动，有着更高的美联社基因依赖性和传输速率。
三幅 2：RDS 诱导 SARS-CoV-2(GFP) 假型受到感染者受到感染 A549(ACE2) 肝细胞。
A.A549(ACE2) 肝细胞用 RDS 近十年一系统性 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 假型受到感染者受到感染。将肝细胞彩衣去受到感染者和 RDS，并在不长期存在 RDS 的情况展开培植。流式肝细胞仪监测受到感染者受到感染诱导情况。未受到感染的肝细胞和受到感染 SARS-CoV-2(GFP) 但不予 RDS 病患的肝细胞作为相比较。GFP+肝细胞百分比已看出。(PI) 氯化丙啶。
B.RDS 的肝细胞毒素系统性。A549(ACE2) 肝细胞用 RDS 近十年一系统性 4 星期，彩衣去 RDS，无 RDS 培植 48 星期。氯化丙啶切片鉴定正在受害肝细胞和已受害肝细胞，流式肝细胞拳法数据资料分析。绘制剂量-底物肝细胞毒素圆弧，RDS 的半受害碱度 (LC50) 分之一为 1:11.9。
如三幅 3A 下图，我们用到 Luc 调查报告基因假受到感染者和 VeroE6 肝细胞展开受到感染实验室，检视到 RDS 对该受到感染者受到感染有着副作用反之亦然诱导抑制作用，并且半数诱导碱度确切为 1:230RDS 一系统性度 (三幅 3B)。我们还系统性了 RDS 对 VeroE6 肝细胞能充满活力的阻碍，确切了 50% 肝细胞受害副作用为 1:11.8RDS 一系统性度。
三幅 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 假受到感染者和野生型 SARS-CoV-2 受到感染者的副作用反之亦然诱导诱导抑制作用。用 RDS 近十年一系统性模板 A、BVeroE6 肝细胞，需用 SARS-CoV-2(Luc) 假型受到感染者受到感染。将肝细胞彩衣去受到感染者和 RDS，并在不长期存在 RDS 的情况展开培植。在受到感染后 72 星期用白光素酶监测受到感染者受到感染的诱导抑制作用。未受到感染肝细胞和 SARS-CoV-2-luc 受到感染但不予过 RDS 病患的肝细胞作为相比较。实验室单调三次。绘制剂量底物圆弧和 RDS 的 I-C50 一系统性分之一为 1:230。CRDS 对 VeroE6 肝细胞的肝细胞毒素也通过氯化丙啶切片和流式肝细胞拳法系统性。用 RDS 近十年一系统性 4 星期，彩衣去 RDS，在不则有 RDS 的情况培植 72 星期。插图肝细胞毒素副作用-底物圆弧，RDS 的半受害碱度 (LC50) 分之一为 1:13.8 一系统性。DRDS 诱导传染性 SARS-CoV-2 受到感染。用近十年一系统性的 RDS 模板 VeroE6 肝细胞，并在 RDS 长期存在的情况受到感染 SARS-CoV-2。受到感染 48 星期后，通过怪菌斑数据资料分析受到感染者被囚后的受到感染者克隆诱导情况。诱导试验性一式三份展开，并在 Prism7(Graph Pad) 之前用到单向方差 (One-Way ANOVA) 数据资料分析及 Dunnett 后检查 (Dunnett's Post Test)，以此确切统计学显着性。显着性值用请注意说明如下：*p
为了更进一步正确性用到假受到感染者取得的结果，我们测试者了 RDS 对于 SARS-CoV-2 受到感染的切断传染性战斗能力。如三幅 3D 下图，RDS 同时也切断了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 肝细胞的受到感染。RDS 在一系统性 1:40 以上时可显着提高受到感染者淡褐色的形成。
综上，通过 SARS-CoV-2 假受到感染者与传染性受到感染者的结果表明，RDS 则有有诱导 SARS-CoV-2 受到感染的能活性糖类，或许是通过实际上灭能活受到感染者或切断受到感染者的晚期受到感染延迟。
为更进一步研究成果或许的选择性，我们将传染性 SARS-CoV-2 受到感染者粒状与近十年一系统性的 RDS 在 37°C 下预培植 1 星期。随后，将固体更进一步依次一系统性-(10–1 至 10–4)，并转入 Vero 肝细胞展开怪菌斑数据资料分析以确切受到感染者受到泌尿道的减缓。如三幅 4A 下图，我们检视到在 RDS 之前短暂暴露一星期后的受到感染者粒状，其 SARS-CoV-2 的受到感染效价也深褐色副作用反之亦然降低。该结果声称了 RDS 可理论上实际上灭能活 SARS-CoV-2 受到感染者粒状的传染性。
我们更进一步测试者了 RDS 到底也能诱导 SARS-CoV-2 受到感染者兰花的受到感染。为此，我们需用最近共同开发的混合甲受到感染者-SARS-CoV-2 假型受到感染者 (Ha-CoV-2)[31] 来催化一前传 S 细胞内值得注意，之外英国值得注意 (B.1.1.7)，南非值得注意 (B.1.351)，巴西值得注意 (P.1)，旧金山值得注意 (B.1.429)，和其他几个新兴值得注意 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和系统性 S 细胞内反转体在 37°C 近十年一系统性 RDS 培植 1 星期。随后，用该固体受到感染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶肝细胞。受到感染后 12 星期，白光素酶校准受到感染者受到感染的诱导抑制作用。如三幅 4B 下图，我们还检视到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 细胞内值得注意的副作用反之亦然诱导。
我们还测试者了 RDS 切断 SARS-CoV 受到感染的战斗能力，用到带有 SARS-CoV 突刺细胞内的 GFP 美联社基因太快受到感染者和[15] 逆副作用。我们将人 A549(ACE2) 肝细胞需用靶肝细胞，将其用前传一系统性的 RDS 模板，然后用 SARS-CoV(GFP) 调查报告基因假受到感染者受到感染 4-6 星期。受到感染后在不则有 RDS 的情况培植肝细胞，流式肝细胞拳法系统性监测其对受到感染者受到感染的诱导抑制作用。举例来说，用到氯化丙啶排除正在受害与已受害的肝细胞，至少在能活肝细胞群之前数据资料分析 GFP+肝细胞。如三幅 5A 下图，我们检视到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 假型受到感染者的诱导抑制作用深褐色副作用反之亦然。我们更进一步声称了这些结果，并系统性了 RDS 介导的诱导与 Luc 美联社基因 SARS-CoV 假型受到感染者，SARSCoV(Luc)。我们检视到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的诱导抑制作用深褐色副作用性依赖，其半诱导碱度 (IC50) 为 1:70.88 一系统性度 (三幅 5B，C)。考虑 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都用到 ACE2 受到感染靶肝细胞，我们还测试者了 RDS 的效受到感染者能活性到底至少针对与 ACE2 有相互抑制作用的病原受到感染。为此，我们监测了一种无关负链 RNA 受到感染者--SARS病毒SARS受到感染者。它通过受到感染者血凝素 (HA) 和肝细胞α-唾液碱来受到感染靶肝细胞。为了催化SARS病毒SARS受到感染者，将强调SARS病毒SARS A/WSN/33(H1N1) 基因序列每个影片的 8 个媒介和一个 GFP-美联社基因共转染到 HEK293T 肝细胞之前。在 RDS 长期存在的情况，收集受到感染者粒状并可用受到感染期望 MDCK 肝细胞。如三幅 6A 下图，我们检视到 RDS 对SARS病毒SARS受到感染者的诱导抑制作用深褐色副作用反之亦然。RDS 在 1:40 和 1:80 一系统性时可仅仅切断受到感染者受到感染，在 1:160 一系统性MLT-可部分诱导SARS病毒SARS。RDS 对 MDCK 肝细胞的半受害碱度 (LC50) 经校准为 1:18.5(三幅 6B)。这些结果表明，RDS 的效受到感染者能活性并非针对特定受到感染者，而或许只能广为诱导多种颤动道受到感染者，如病原受到感染和SARS病毒SARS受到感染者。
▋讨论
在本调查报告之前，我们断言了现代制剂欲求肺毒制剂液 (RDS) 则有有广谱效受到感染者能活性，可切断 SARS-CoV、SARSCoV-2 和SARS病毒SARS受到感染者的受到感染。虽然 RDS 只能诱导多种受到感染者，但其效受到感染者能活性因受到感染者特性和毒株而异。例如，对 SARS-CoV 太快假受到感染者的 I-C50 碱度为 1:7.9 一系统性度，对 SARS-CoV-2 太快假受到感染者的 I-C50 碱度为 1:230 一系统性度。对于传染性野生型 SARS-CoV-2 受到感染者，I-C50 为 1:40 一系统性度，对SARS病毒SARS，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其兰花有不同的诱导抑制作用，IC50 数量级从 1:70 到 1:2601 一系统性度不等 (三幅 4B)。
(闻下一页三幅)
三幅 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和独有的 Ha-CoV-2 兰花有着副作用反之亦然灭能活抑制作用。ASARS-CoV-2 粒状赞近十年一系统性的 RDS 在 37°C 下培植 1 星期。随后，将固体更进一步近十年一系统性，并转入 Vero 肝细胞之前展开怪菌斑数据资料分析，以确切受到感染者受到泌尿道减缓。诱导试验性一式三份展开，并在 Prism7(GraphPad) 之前用到单向方差 (One-WayANOVA) 数据资料分析和 Dunnett 后检查 (Dunnett'sPostTest) 以此确切统计学显着性。显着性值用请注意说明如下：*p
BHa-CoV-2(Luc) 和系统性 S 细胞内值得注意与近十年一系统性的 RDS 在 37°C 培植 1 星期后，用固体受到感染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶肝细胞。受到感染后 12 星期，白光素酶校准受到感染者受到感染的诱导抑制作用。RDS 的 IC50 值的一系统性度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。
我们更进一步断言了 RDS 可以诱导病原受到感染的晚期受到感染延迟。虽然具体情况的效受到感染者选择性已为可信，但 RDS 可以通过实际上灭能活受到感染者粒状或通过解救受到感染者渗透或切断受到感染者渗透后的晚期延迟来解救受到感染者受到感染。在其他几种现代籽之前也注意到了效 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的能活性。例如，一种常闻的现代籽——绿叶。
绿叶根之前已断言则有有绿叶碱素，可诱导 SARS 受到感染者[32] 临床受控株的克隆。此外，另一种可可用病患颤动道癌症的籽——双黄连制剂，已看出不止在灌注以副作用反之亦然方式诱导 SARS-CoV-23CL 丝氨碱 (3CLpro) 能活性。龙胆苯甲碱和龙胆素拟作为双黄连切断 3CLpro[33] 的理论上糖类。
三幅 5 RDS 诱导 SARS-CoV 假型受到感染者对 A549(ACE2) 肝细胞的受到感染。用近十年一系统性的 RDS 模板 A、B 肝细胞，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 假型受到感染者受到感染。将肝细胞清彩衣，去除受到感染者和 RDS，在不长期存在 RDS 的情况展开培植。在受到感染后 48 星期和 72 星期，通过流式肝细胞拳法或白光素酶监测来系统性受到感染者受到感染的诱导抑制作用。实验室单调三次。绘制剂量响应圆弧，并插图 RDS 的 IC50 值为 1:70.9 一系统性度 (C)
三幅 6 RDS 诱导甲流受到感染者对 MDCK 肝细胞的受到感染。(A) 用近十年一系统性的 RDS 模板 MDCK 肝细胞 30 分钟，然后用甲流受到感染者 (GFP) 对其展开受到感染。受到感染后，在 RDS 长期存在下培植肝细胞。36 星期后用流式肝细胞仪对受到感染者受到感染的诱导抑制作用展开系统性。把未受到感染的肝细胞与被甲流受到感染者 (GFP) 受到感染但不予 RDS 处理方式的肝细胞展开对比。三幅之前看出了 GFP+肝细胞的百分比。PI 说明氯化丙啶 PI。
(B) 另外还用到了 MTT 校准法系统性了 RDS 对 MDCK 肝细胞的毒素，插图了肝细胞毒素的副作用-底物圆弧，经计算，RDS 的半数受害碱度为 1:18.5 一系统性度 RDS 的理论上效受到感染者糖类已为确切。然而，RDS 不同于龙胆苯甲碱和龙胆素，RDS 可以通过实际上灭能活受到感染者带电粒子来切断受到感染者受到感染 (三幅 4)，而龙胆苯甲碱和龙胆素则在受到感染者生命周期的中后期通过切断受到感染者丝氨碱的能活性来发挥抑制作用。然而，RDS 的灌注效 SARS-CoV-2 能活性仍需在今后的类动物研究成果和人类文明乳腺癌之前给予声称。现前期，我们正在展开小型类动物实验室，以确切 RDS 在人体内切断 SARS-CoV-2 受到感染者受到感染的潜力。
▋论断
我们的研究成果表明，RDS 可广为诱导颤动道受到感染者的受到感染，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和SARS病毒SARS。
▋方式
肝细胞和肝细胞培植
HEK293T (ATCC 博拉奇克，弗吉尼亚) MDCK (ATCC 博拉奇克，弗吉尼亚)，VeroE6 (ATCC 博拉奇克，弗吉尼亚) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 获赠，博拉奇克，弗吉尼亚)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 获赠，博拉奇克，弗吉尼亚) 现前期保存于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔新技术 Thermo Fisher Scientific) 则有有 10% 波灭能活 FBS 和 1×青霉素-效生素 (赛默飞世尔新技术 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 肝细胞培植基之前分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的碱度转入嘌呤霉素和潮霉素 B。
真核生物转染和受到感染者催化
则有 SARS-CoVS 细胞内或 SARS-CoV-2S 细胞内的太快性假型受到感染者粒状由 Virongy LLC (Manassas，VA) 发放，或按照后面详细描述的方式[15] 催化。简言之，为了催化 GFP 美联社基因太快性假受到感染者，HEK293T 肝细胞与强调 SARS-CoVS 细胞内或 SARS-CoV-2S 细胞内的媒介、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共转染。为了产不止白光素酶美联社基因太快性假型受到感染者，将 HEK293T 肝细胞与强调 SARSCoVS 细胞内或 SARS-CoV-2S 细胞内的媒介、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 展开共转染。转染后 48 星期收集受到感染者上清液，离心精制，−80℃ 保存。野生型 SARS-CoV-2 受到感染者 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 发放。pHW-NAGFP (ΔAT6) 调查报告基因真核生物和 A/WSN/1933 H1N1 独有真核生物 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 麻省理工所学院友好发放。在SARS受到感染者 A-GFP 美联社基因带电粒子催化之前，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共转染 HEK293T 肝细胞 (ΔAT6)。48 星期后收集受到感染者上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 强调媒介售给 Sinobiological。需用 Twist Bioscience 催化了 Ha-CoV-2(Luc) 媒介和 S 细胞内反转媒介。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 细胞内反转带电粒子按照后面详细描述方式[31] 展开催化。
受到感染者受到感染和制剂诱导试验性
RDS(欲求肺毒制剂液)(来自 Dejia Harmony 获赠，利斯堡，弗吉尼亚) 是由一匹马麻省理工所学院研究中心 (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种商业性新产品。RDS 之前所有之前药用植物糖类仅符合《之前国药典 2015 年版》「饮片」标准，之外理论上糖类则有量及重金同属、农药限量监测。RDS 是一种籽的共煎剂，再一产物在密闭条件下蒸发。SARS-CoV-2 效血清由 LanceA. Liotta 药剂师发放。将纳西朵尔盐碱盐 (Sigma) 重新悬浮在二烷基亚砜 (Sigma) 之前。对于假型受到感染者受到感染，12 孔板之前的 A549(ACE2) 肝细胞 (来自 Virongy LLC 获赠，博拉奇克，弗吉尼亚) 或 VeroE6 肝细胞用 RDS 模板 30 分钟，在 37℃ 下受到感染 4-6 星期，然后在新鲜培植基之前冲彩衣培植 48-72 星期。对于 VeroE6 肝细胞的受到感染，肝细胞也被 CoV-2 假型受到感染者受到感染增强剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 获赠，博拉奇克，弗吉尼亚) 模板后，在 37°C 下再行处理方式 30 分钟。用到 GloMaxDiscover 酶标仪 (Promega) 数据资料分析肝细胞裂解物的白光素酶能活性。对于野生型 SARS-CoV-2 受到感染，VeroE6 肝细胞在 37°C 下用 RDS 模板 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 受到感染 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在伊丽莎白汤普森所学校的 BSL-3 收容设施内停留 1 星期。肝细胞用 PBS 冲彩衣 2 次，用则有 RDS 的培植基培植 48 星期。从上清之前催化受到感染者，用 12 孔板培植的 Vero 肝细胞单层之前的怪菌斑试验性校准小瓶滴度。简言之，每个样品在完整的 Dul-becco's ModifiedEagle 培植基 (VWR) 之前催化，包则有 1X 青霉素-效生素 (VWR)，并去掉 10% 的 FBS(赛默飞世尔新技术 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种一系统性液滴附到 VeroE6 肝细胞单层的三个平行孔上 1 星期。然后用 1～2 ml0.6% 长丝糖 (Invitrogen) 和一部分完整的 Eagle Minimal Essential 培植基 (VWR) 的固体延展单层，则有 1X 青霉素-效生素，并去掉 10%FBS。48 星期后，将单层凝胶固定在 10% 甲醛硫酸之前 1 星期，并去除延展的长丝拉。为了切片淡褐色，转入则有有 20% 乙醚的 1% 结晶紫精油硫酸 5 分钟，然后用去离子水冲彩衣。对于SARS病毒SARS受到感染者受到感染 MDCK 肝细胞，在 37°C 下用 RDS 模板 30 分钟，然后用 A-GFP 美联社基因受到感染者受到感染 6 星期。用则有 RDS 的培植基冲彩衣肝细胞，培植 36 星期。GFP 强调通过流式肝细胞仪系统性。(FACSCalibur，BD Biosciences).
对于 SARS-CoV-2 受到感染者粒状的 RDS 灭能活试验性，将 100μl 近十年一系统性的 RDS 去掉到 1 mlSARS-CoV-2 受到感染者原液 (3.65×105PFU/ml) 之前，再一 RDS 一系统性为 1:20，1:40 或 1:80。也之外相比较条件 (1 ml 受到感染者+100μl 培植基)。固体在 37°C 下培植 1 星期。随后，对固体展开前传一系统性以显现出额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 一系统性度，并将近十年一系统性的样品转入 12 孔板之前的 Vero 肝细胞之前，可用展开怪菌斑校准数据资料分析。淡褐色校准之前再一的 RDS 一系统性度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 一系统性液。
Ha-CoV-2(Luc) 和 S 细胞内反转带电粒子按照后面详细描述的方式[31] 催化。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭能活，将 5μl 近十年一系统性的 RDS 去掉到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或值得注意之前，再一 RDS 一系统性度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将固体在 37°C 下培植 1 星期，然后在 RDS 长期存在下受到感染 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 肝细胞 12 星期。用到 GloMax Discover 酶标仪 (Promega) 数据资料分析肝细胞裂解物的白光素酶能活性。
肝细胞毒素数据资料分析监测
用氯化丙啶切片和流式肝细胞拳法系统性对 A549 (ACE2) 肝细胞和 VeroE6 肝细胞的制剂肝细胞毒素展开监测，如所述 (34)。用到肝细胞增殖氢化盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商劝告的方案对 MDCK 肝细胞的制剂毒素展开系统性。简言之，将 MDCK 肝细胞 (ATCC) 以每孔 1×-105 个肝细胞的更快接种到 12 孔板之前。肝细胞培植隔夜后，通过 RDS 处理方式 1 天，然后在 MTT 标记氢化 (Sigma) 的培植基之前培植。将肝细胞与标记氢化共同培植 4 星期，再行后续转入 MTT 增硫酸。培植皿孵育往常，用 GloMax Discover 酶标仪 (Promega) 校准滴视星等。
首字母
SARS-CoV：致使急性颤动系统会癫痫系统性病原受到感染；SARSCoV-2：Severe 致使急性颤动系统会癫痫系统性病原受到感染-2；TCM：现代籽；RDS：颤动道排毒制剂液；Ha-CoV-2：混合SARS病毒新冠受到感染者假受到感染者。
致谢
致谢 FengLi 发放SARS受到感染者强调媒介，致谢 LanceLiotta 发放效毒血清；致谢 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的讨论与劝告；致谢 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 发放 RDS 和药用植物催化物。
所写作出贡献
此次实验室由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 设计，由 Y.W. 撰稿，由 L.A.H. 编辑。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该实验室。所有所写已阅读并批文再一草稿。
收益
本研究成果的支出来自于伊丽莎白汤普森所学校内部拨款 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该款项由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 发放。
数据资料和涂层的安全性
本研究成果之前显现出或数据资料分析的所有数据资料仅包则有在本文之前。氢化可从 Y.W 处赚取。
声明
批文及作准备拒绝
不适用
拒绝不止版社
不适用
垄断利益
伊丽莎白汤普森所学校国内脊椎动物城防和狂犬病之前心的 RMH 和 YW 已取得了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的研究成果资助，LAH 为德佳和畅担任顾问并取得了酬金。没有其他人关系或能娱乐活动或许但会阻碍到提交的工作。
所写详细信息
1旧金山弗吉尼亚伊丽莎白汤普森所学校系统会脊椎动物学所学院国内脊椎动物城防和狂犬病之前心，博拉奇克 20110。
2VirongyLLC，弗吉尼亚博拉奇克。3赞拿大人福纳比，BCV5J0E5 一匹马麻省理工所学院研究中心 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 旧金山弗吉尼亚利斯堡世界卫生科学知识民间组织，20176。
收稿一月：2021 年 4 年末 7 日
接受一月：2021 年 5 年末 10 日
线上不止版社时间：2021 年 5 年末 29 日
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编辑： 翟极限男相关新闻
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